摘 要： 综述了激光诱导击穿光谱（LIBS）成像技术的基础原理以及在生物和医学检测中的技术发展，对比了不同数据处理方式的特点及应用场景。在植物样品元素成像领域，LIBS成像技术可用于研究金属在植物各个组织或器官的迁移转化规律，为研究生物代谢过程与毒理学提供技术支撑；在动物样品元素成像领域，LIBS成像技术可以实现空间分辨率为亚微米级别的金属纳米颗粒原位检测，并可结合多元素的3D分布结果用于研究生物病理学规律；在人体相关的医学研究中，LIBS成像技术可以用于个人生物信息识别以及改进临床诊断、识别癌症细胞等方面。提出了LIBS在元素成像、原位检测等应用领域中所面临的问题和挑战，以期通过改进数据处理方式、开发原位微区无标准样品定量/半定量分析、与人工智能相结合等方式，使得LIBS在生物医学领域中具有更广泛的应用前景。

 

关键词： 激光诱导击穿光谱仪（LIBS）； 元素成像； 生物医学； 定量分析； 应用进展

 

近年来，随着激光诱导击穿光谱(LIBS)技术的发展，其检测性能得到显著提升，已广泛应用于生物、医学、地质、材料分析等多个领域的微观元素成像研究[1]。LIBS通过超短脉冲激光聚焦样品表面，激发该区域原子或离子形成离子体，然后对等离子体发射光谱进行分析可获得样品中元素的成分及含量[2]。该方法可以从单个激光脉冲中完成元素测量，脉冲通过激光烧蚀采样的同时，还可以通过加热等离子体使烧蚀的蒸气原子化并激发。基于此特性，LIBS成像技术具有仪器简单、检测速度快(高达kHz)、兼容常规光学显微镜系统等优点，并可与其他技术(如拉曼光谱等)进行联用[3]。LIBS成像还具有多元素同时检测、可测量轻质量元素、元素检出限低(多数元素达μg/g量级)、空间分辨率高(微米级)等优点。作为一种兼具元素高灵敏度和空间分辨力的检测方法，LIBS成像可以与激光剥蚀-电感耦合等离子体质谱(LA-ICP-MS)、同步辐射微区X射线荧光(μXRF)、电子探针(EPMA)等分析方法形成互补，开展联合检测的应用研究[4]。

 

关于LIBS相关技术的报道始于20世纪60年代初期，当时对LIBS的研究主要集中在微量元素定量分析领域[5]。随着性能更强的激光器及矩阵探测器的出现，该技术大量应用于样品微观尺度分析中，如陶瓷样品中铈的分布、以kHz的工作速率研究钢材中多种杂质元素分布、大尺度样品表面分析及元素的三维成像分析等[6]。之后随着增强电荷耦合探测器(ICCD)的面世，LIBS元素成像技术的检测速度更快、灵敏度更高。由于生物医学样品具有采样量少且难以获取重复样品、基体复杂、干扰因素多、待测元素浓度波动范围大、样品制备过程复杂等特性，相较于其他成像设备，高速、高灵敏度、高分辨率的LIBS元素成像技术在生物医学组织成像领域开拓了新的应用方向。伴随着超高分辨率(百万级像素)图像的技术突破，LIBS元素成像已成为在生物医学前沿研究中应用最广泛的技术之一[7]。近年来，LIBS仪器开发研究主要集中于光谱采集的后期数据处理技术。由于LIBS成像在生物医学领域的应用需要处理大量数据，而该类样品中主要化合物、次要化合物和痕量元素的光谱数量存在显著差异及干扰，所以优化数据处理方法(如化学计量学的应用)将成为LIBS技术未来的发展方向与挑战。笔者主要概述了LIBS成像技术在生物及医学领域的最新进展与应用研究，同时对LIBS成像数据处理技术的发展趋势进行了简要探讨。

 

1 LIBS成像技术简介

1.1 LIBS成像原理

LIBS成像的原理是将高能量脉冲激光聚焦在目标区域样品上，以烧蚀少量样品表面(样品量通常为微克或更少)并激发烧蚀的样品产生一系列等离子体，激光诱导产生的等离子体寿命约几微秒，温度为10 000 K左右，该类方式可以激发绝大多数元素。然后，不同元素通过发射自身独有光谱特征谱线返回基态，包含特征元素的等离子体发射的光被不同的光学元件(如透镜、聚焦镜或光纤等)收集，随后采用光谱仪对不同光谱的波长和强度进行分析处理[8]，识别检测到特定元素的特征发射谱线，从而构建相应的元素分布图像[9]。在发射光谱上观察到的谱线(原子、离子或分子)的强度与样品的元素组成直接相关。在样品测定过程中，样品通常放置在可编程的电动XY载物台上，载物台移动的步长(即连续激光照射之间的距离)决定了元素图像最终的分辨率[10]。通常，最小分辨率由激光剥蚀坑大小决定，一般情况下不会在连续的激光照射之间获取样品重叠区域的谱线，因为该操作会导致测量重复性降低[11]。在大多数情况下，光谱仪更容易收集固定位置等离子体发射的光，因此LIBS成像仪器大多采用样品移动的方式，而不是用可移动的激光束进行扫描[12]。然而，对于需要对大型样品表面进行高频率扫描的特定应用场景(如样品的在线控制)，也可以同时使激光束与光谱采集系统连续移动[13]。

1.2 LIBS成像仪器配置

LIBS成像的仪器配置受多个因素的影响，主要包括激光聚焦系统、激光源、检测系统及数据处理等因素[14]。激光聚焦系统决定了LIBS成像结果最终的分辨率，焦距越短，工作距离越小，剥蚀尺寸越小，分辨率越高；在剥蚀区域通入流动的氩气，可提高该剥蚀区域内等离子体的隔热性和准直性[15]。为提升LIBS成像检测质量，通常可以通过抛光实现样品表面的干净与平整，以保证整个成像过程中光学系统焦平面的定位[16]。LIBS激光源的输出能量、脉冲时间及激发方向等方面的稳定性直接影响作用于样品上剥蚀等离子体及检测信号收集产生的波动效应，在LIBS成像检测均匀样品的微量分析中，激光的单点发射稳定性更为关键[17]。LIBS检测系统包括光谱仪和探测器，需综合考虑光谱分辨率、光谱测量范围(多元素检测能力)、光谱仪亮度(测量灵敏度)、运行速度及成本等参数的影响[18]；当激光发射频率超过一定阈值(通常大于200 Hz)时，传统耦合矩阵探测器的响应速度可能无法匹配激光发射频率，因此需要采用响应速度更快的传感器(如更快感光材料)，以提高检测灵敏度[19]。LIBS成像的数据处理主要是提取光谱数据，并将其转化为具有特定元素空间分布的图像形式[20]，其中需要考虑样品基质效应、光谱干扰、谱线自吸收现象等的影响[21]。

 

2 LIBS成像技术应用

LIBS成像具有微米级分辨率、检出限低至μg/g量级、检测速度快(高达kHz)等独特的优势，其在应用研究中可与其他光谱成像技术(如LA-ICP-MS、微区XRF等)形成互补。近年来，LIBS成像在生物或医学领域有更为广泛的应用，例如在植物、动物、人体组织样品中的内源性化学元素直接成像方面，为研究生物器官的病理生理状态提供了更全面的技术支撑。生物医学样本通常在细胞含量方面具有高度异质性，同时不同生物体(例如植物、动物、人体)组织中的细胞与病理生理细胞化学成分也存在多样性，而LIBS的元素成像可在样本没有预处理的前提下，为临床研究人员收集样品表面完整的光谱化学信息，例如在微米级的给定组织区域中，LIBS成像可以通过肌肉细胞周围的上皮细胞以及含有血细胞的邻近血管确定骨组织。在生物医学中，除了血液或其他体液的分析，生物组织元素LIBS成像技术比其他微量分析技术具有明显的优势[22]。

2.1 LIBS成像技术在植物组织中的应用

LIBS成像技术可针对植物不同的部位(如根、茎、花或果实)进行扫描，获得的元素分布信息有助于了解植物潜在的营养(钠、钾、磷等)失调过程，营养失调过程的研究可应用于植物的健康、疾病、营养摄入不足，或受到污染的大气、水、土壤的溯源工作中[23]。为了研究植物根际养分交换的空间控制，LIBS元素成像可用于对根际土壤系统中有机物含量和无机成分成像研究，该研究实现了在长度约1 mm的柳枝草根小样本上，获得了分辨率约为100 μm的17种常量营养元素、微量营养元素和基质元素的分布图像及精细的化学梯度分布规律。该研究表明，LIBS成像技术适合作为一种有效的空间分辨技术用于微小样品，如复杂土壤基质和植物根际的快速、高灵敏度多元素同时采集分布研究[24]。LIBS元素生物成像也可用于测量富硒对可食用蘑菇中可扩散内源性阳离子分布的影响，研究发现，富硒改变了钾和镁的分布，增加了蘑菇下部钙的生物累积，由此可以推断，硒改变了钙、钾和镁的运输和区室化过程，从而影响其生物代谢过程[25]。LIBS成像还可用于分析轻质元素，例如分析斑点罗汉果叶片中锂的分布[26]；采用双脉冲方式还可用于研究水稻叶片中铬的分布规律[27]。LIBS成像技术可用来辅助检测白芥作物(Sinapis alba L.)中镉的分布，通过将LIBS成像与微区LIBS相结合，分别实现了100 μm和25 μm的横向分辨率，由此检测到暴露于氯化镉溶液或碲化镉量子点的植物根部中镉的不同空间分布规律[28]。使用纳米粒子增强激光诱导击穿光谱(NELIBS)，可显著提高检测植物中有害化学物质的灵敏度，通过空间分辨的方式分析镉等有毒物质在生菜叶片和茎中的分布，结果发现，重金属在可食用植物叶片中分布不均匀，叶脉中的浓度高于叶肉。该研究表明相比于传统LIBS技术，NELIBS的灵敏度可提高2个数量级[29]。

2.2 LIBS成像技术在动物组织中的应用

仪器分析技术的选择对于生物组织中金属纳米化合物的成像至关重要[30]，检测生物组织元素成像技术主要包含粒子激发X射线荧光分析(PIXE)、X射线荧光显微技术(XFM)、二次离子质谱(SIMS)和LA-ICP-MS等，几乎所有的元素成像技术都被用于直接检测脑组织内的可扩散离子(如Na+、Mg2+、Ca2+、K+和Cl-等)[31]。而微区LIBS成像针对纳米医学和神经学有独特的优势，例如在脑元素成像领域中可使用LIBS实现内源性化学元素(如P、Mg、Ca、Na、Cu和Fe)的可视化[32]。LIBS成像技术是研究整体器官尺度上重金属稳态时空调节的最可靠工具，例如利用LIBS对大脑中的Zn、Ca、Mg、Na、Cu和P等分布进行成像和定量分析。LIBS成像技术结合3D成像模型有助于研究胚胎发育过程，可用于研究大脑结构发育和成熟过程中Zn的分布和时间调控规律[33]。LIBS成像技术同样适合对动物器官中金属纳米颗粒(NP)进行检测，用以研究治疗剂的药物代谢动力学或生物组织中内源性元素的病理生理过程。LIBS与X射线荧光相结合，用于纳米簇的超小发光金(Au)颗粒在动物的器官和皮下移植肿瘤中的分布研究，通过LIBS成像可发现肾脏中Au NP的高积累，而在肝脏和脾脏中几乎没有检测到Au NP，该结果可用于评估金属NP在生物体内的药物代谢动力学过程，表明该创新化合物在非常快的时间尺度上优先通过尿液排出。该研究表明LIBS成像可在动物组织尺度与亚细胞尺度的元素成像积累分布规律研究中发挥重要作用[34]。金属NP生物成像方面最显著的进步之一是利用双脉冲LIBS技术研究铟NP在细胞内的分布，该研究使LIBS成像技术在生物研究中首次超越微米级分辨率，其纳米激光探针可将横向分辨率提高到500 nm；采用飞秒激光(采样515 nm)与纳秒激光(发射266 nm)的组合实现了金属NP在单个细胞内的可视化，研究发现铟元素图像与细胞中溶酶体的荧光图像精确对应，表明NP在被溶酶体捕获之前通过内吞作用进入细胞。采用双脉冲LIBS检测技术不仅首次获得了金属NP在细胞器中亚细胞分布的高分辨像，而且其绝对检出量降低至18.3 fg，为有关金属NP和细胞之间行为和相互作用机理研究提供了有效技术支撑[35]。将LIBS成像应用于患有原位胶质母细胞瘤的老鼠大脑中，对其中镧(La)、铈(Ce) NP进行成像研究，发现在肿瘤部位同时存在La和Ce，证明药物对放射治疗有积极反应。该研究实现了金属NP原位检测的高稳定性，表明LIBS成像可间接反映抗癌治疗的疗效[36]。LIBS成像技术还具有可以检测轻元素的优势，在一项基于中子捕获的创新放射治疗研究中，为匹配放射治疗的发展需求，采用LIBS成像成功确定了携带肿瘤的鸡胚模型中含硼荧光团的分布。这类针对轻元素硼的成像研究，彰显了LIBS在生物领域应用的巨大潜力[37]。LIBS还可以通过使用等离子体的分子发射间接分析元素分布，例如在针对鲨鱼牙齿的研究中，通过CaF分子的光谱发射线进行了氟成像[38]。分子发射在LIBS中的应用研究也是一个不断发展的新领域，可为单独分析某一元素成像提供辅助支撑[39]。例如，在移植黑色素瘤细胞的小鼠皮下组织中，采用LIBS成像原位检测肿瘤部位的K元素发射信号和碳氮分子(CN)发射信号，获得的高分辨率元素分布信息成功实现了黑色素瘤和周围非恶性真皮之间的区分[40]。法国研究小组率先开发和改进了LIBS技术用于对动物组织的元素含量的生物成像研究[8]，使用基于紫外线的LIBS成像以多元素和定量方式研究钆硅基纳米颗粒分布规律，在静脉注射后对不同时间点收集的小鼠环氧树脂包埋肾脏进行了元素分析，实现了40 μm的图像分辨率的分布结果[41]。随后切换到红外激光源，在肾脏和整个器官尺度上对相同的小型治疗纳米化合物进行3D成像，在3个维度上获得了约10 μm的高分辨率元素分布图像[42]。之后该研究小组在人类标本上实现了LIBS成像研究，获得软基质2D-LIBS多元素分析结果，即人类石蜡包埋皮肤活检、生成正常皮肤和一系列皮肤癌中内源性多元素分布图[43]。

2.3 LIBS成像技术在人体组织中的应用

随着LIBS成像设备的快速发展和低成本化，其在指纹识别中发挥重要的作用。LIBS成像技术可以根据每个指纹的特定化学成分而消除多个重叠指纹的干扰，这一突破可能在需要分析指纹的犯罪调查中得到广泛应用[44]。通常采用单点LIBS和主成分分析(PCA)很难区分两个不同人的指纹，而结合LIBS成像技术利用125 μm的横向分辨率，通过软件建模分析，可以实现重叠情况下对每个指纹进行重建[45]。通过分析人类肉芽肿、淋巴结或疤痕标本或体液等异常组织病理学特征的元素含量，人们首次实现了LIBS成像在临床医学中的应用。研究发现，LIBS成像可用于研究外源性可溶性化合物(如Al化合物、Ti或W的金属颗粒、Cu等元素)在人体组织中的分布[46]。LIBS成像技术在人类病理学中应用最广泛的是在改进癌症诊断方面，主要在人体液体(血液或血清)或生物组织的微量元素分析及空间分布中发挥重要的作用[47]。在癌症实体病肿瘤异质性研究中，LIBS成像发现了正常皮肤与癌症皮肤元素分布之间的明显差异，针对人体皮肤组织及癌变细胞(如恶性黑色素瘤、鳞状细胞癌和默克尔细胞癌等)中Na、K、Mg和Ca等元素，结合生物组织算法聚类分析，实现了元素分布信息与生物组织之间的精准定位[48]。该方法还成功用于研究人体肺部样本中元素(Ca、Mg、Na、C、Al、Fe、Si和Cu)以及分子片段(CN和C2)的元素分布，使用K-因子算法可对每个像素的元素信息进行分类研究，并发现了LIBS金属成像在识别、定位和筛选肺病标本临床应用的可行性[49]。LIBS在临床医学应用中，还需要结合化学计量学与医学生物信息的多维性，以提高亚微米级分辨率对内源性和外源性元素进行成像与定量研究，目前的研究大多集中在元素的半定量基础上[50]。在未来的发展趋势中，对于元素分布中元素浓度的定量分析是临床医学必不可少的部分，微区无标准样品定量分析方法的开发与应用将成为LIBS成像在临床研究中所面临的巨大挑战[51]。

 

3 LIBS成像的数据处理

LIBS成像具有非常高的动态范围、可检测几乎所有元素、收集速度快、空间分辨率高、适用微区样品分析等特点，同时由于LIBS光谱呈现出众多精细的发射谱线，导致其数据分析与处理工作量巨大[52]。一种由LIBS光谱简单快速生成元素图像的方法是通过在特定波长下对所选元素测量的信号进行简单积分，从而生成其分布图。但是该方法不能消除由于样品基体不同或元素谱线重叠带来的干扰，可能导致最终的元素分布图存在一定的偏差[53]，因此在LIBS光谱数据批量分析中，通常还需要采用其他化学计量学手段对LIBS成像结果进行分析处理。通过特定化学计量学手段的分析过程，通常可以从光谱图中提取更多的化学信息，以提高LIBS数据结果的利用率[54]。LIBS光谱成像技术主要用于探索未知元素或含量的样品，在后期数据分析中采用PCA法可实现无标准样品模式下的定量分析[55]。PCA法可以快速获得复杂样品的初始化学信息，可以识别不同的相关或不相关元素，还能够生成与每个组分间相关性指标，以辅助检测到的元素的空间分布图[56]。例如LIBS成像可用于手写文件的鉴定研究，即使两支钢笔的书写差异目视无法分辨，LIBS成像也可为每种墨水产生不同的PCA组分分析结果，从而对其进行识别。这一应用可用于证明官方手写文件的准确性[57]。LIBS成像也被用于隐藏信息解密分析，通过对具有不同元素组成的墨水进行扫描，能够揭示手写文档中隐藏的信息[58]。聚类分析方法可以在无标准样品定量分析中发挥重要作用，该方法是按相似性对所有光谱进行分组，作为簇在样本特定区域中进行数据处理。例如在识别组织病理学中，通过对皮肤样本上采集的LIBS成像数据集进行聚类分析，实现对未知样品的一次数据采集就能确定肿瘤皮肤的边缘，由此可以在观察到的生物组织上分别显示健康和癌细胞所在的区域[48]。在基于LIBS的成像分析中，因为测量是在单次拍摄过程中进行的，因此没有与图像单个像素相关的强度统计数据，因此不能完整地实现定量分析。然而，可以使用各种类型的模拟标准样品进行“半定量”成像研究。最常见的校准方法是使用已知浓度和成分的模拟标准样品，模拟标准样品与样品的浓度和成分相似，然后采用相同的检测条件进行测试，以建立校准模型[59]。LIBS成像的定量分析一直是限制其发展的重要挑战，传统的定量分析主要是通过特定区域光谱的强度和浓度进行回归分析[60]。但是在微区LIBS光谱批量分析中，很难获得已知浓度的标准样品，不过在食品研究领域，可以通过偏最小二乘法(PLS)回归来进行牛肉、配方奶粉等样本的初步定量研究[61]。LIBS成像微区定量分析未来发展还可结合信号分解法[62]、神经网络结合聚类分析[63]等方法对未知样品的浓度进行预测与定量研究类[64]。

 

4 结论

LIBS成像技术具有诸多优势，随着在新实验方法、仪器开发等方面的发展，其可能以低检出限、出色灵敏度、高分辨率的成像优势在各个领域获得更大的应用空间。在未来的研究中，LIBS成像技术具有以下几个发展方向：(1) 在数据处理阶段还需要更专业的化学计量学方法来提取大量的光谱数据，以消除来自元素自吸收、光谱干扰等造成的测量伪影，导致样品分析谱图失真的影响；LIBS成像技术的发展离不开新的数据处理概念和大量数据管理功能的进步，使用人工智能进行全自动数据的分析与提取是未来LIBS成像化学计量学的发展方向之一。(2) LIBS在检测卤族元素的能力较差，其检出限可能在10-2级别，未来可以通过检测自由基(如CaF或CaCl等)的较强分子发射间接测量这些元素，但是必须要确保这些自由基在等离子体中的可重复和可控性。(3) 对不同基体的复杂样品进行元素定量分析仍然是LIBS成像技术的巨大挑战，可以采用其他微区表征技术如EPMA或LA-ICP-MS等辅助校准LIBS图像的定量结果，上述方法都亟需发现新标准样品，以校准或控制检测结果的准确度，同时在无标准样品前提下的微区定量研究也是推动LIBS成像技术发展的重要手段。

 

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